Zdravím všechny přátele a kolegy modeláře a všechny ty, kdož zachovávají přízeň mému blogu. Zároveň zdravím i všechny mikrobiology, kteří si sem dříve, či později také jistě najdou cestu. Vás všechny vítám u mého dalšího článku.
Není žádným tajemstvím a vlastně ani novinkou že většina mých modelářských projektů nějakým způsobem souvisí s tím, co v životě prožívám, zažívám a co mě nějakým způsobem oslovilo. Dnes si opět ukážeme že modelářsky se dá ztvárnit opravdu cokoli. Jde jen o to mít nápad a vymyslet co a jakým způsobem vytvořit.
Na této fotografii z našeho "odpoledne na praktikárně" mě můžete vidět, jak přeočkovávám bakterie na půdy. Četnický stejnokroj jsem tentokráte musel vyměnit za laboratorní bílou, ale uniforma jako uniforma… Dobře si prohlédněte používané nástroje i pomůcky rozložené na pracovní ploše...
Nepochybuji o tom, že každý z vás o mikrobiologii již slyšel, ale nemohu předpokládat že návštěvníci blogu věnovaného především plastikovým modelům z období 30. a 40. let minulého století budou dopodrobna znát předmět jejího zájmu, konkrétně mikrobiologie lékařské. A proto bych se rád pokusil ve stručnosti tento obor představit. A pokud sem skutečně zavítají opravdoví mikrobiologové, tak prosím o shovívavost a omluvení některých mých výkladů, které se snažím uzpůsobit tak, aby i ty nejzákladnější postupy pochopil každý.
Mikrobiologie je věda zkoumající mikroorganismy (bakterie, viry, houby, prvoky, priony,...). V případě lékařské mikrobiologie pak mikroorganismy takové, jež jsou významné z medicínského hlediska a jsou schopny vyvolat onemocnění u člověka. V praxi se pak hledají a identifikují mikroorganismy v biologickém materiálu (stěry, výtěry, seškraby, punktáty, sputa, výplachy, moče, stolice...). Toto "pátrání" po mikroorganismech se provádí za použití kultivace (=pěstování mikroorganismů na půdách), mikroskopie, hmotnostní spektrometrie (MALDI TOF MS), jejich průkazu pomocí sérologických a genetických metod apod..
A pokud si myslíte, že se vás to netýká, tak jste na omylu. Přemýšleli jste někdy nad tím, jaké mikroorganismy se vyskytují na povrchu i uvnitř vašeho těla a ve vašem okolí? Na klikách dveří, na jízdních kolech, na lavičkách v parku, v půdě a kamenech nebo věcech, které běžně používáte? Například na vašem mobilním telefonu? Ne? Tak to zkuste… Myslím, že kdyby jste si udělali stěry z vašeho okolí a následnou kultivaci, byli by jste překvapeni… Podobně, jako někteří z nás, když jsme ve výuce dostali tu možnost. Byla to opravdu zajímavá zkušenost! I když možná máte někdy pocit, že jste sami, tak na vás i ve vašem okolí jsou miliony a miliony mikroorganismů! Takže člověk není nikdy sám.
Dlouhou dobu jsem přemýšlel nad tím, jak by se dala mikrobiologie uchopit z modelářského úhlu pohledu. Hlavní téma nadcházejícího ročníku PanthersCupu má být "S přírodou v zádech", což byla další motivace ke vzniku tohoto projektu. A jak jsem tak přemýšlel, náhle se mi to v hlavě začalo rýsovat. Řekl bych, že nejtypičtejší "nádoba" v mikrobiologii je Petriho miska. A pak mě napadlo vytvořit takové malé zátiší v měřítku 1:4 se vším, co je pro bakteriologii (můj nejoblíbenější podobor lékařské mikrobiologie studující bakterie) typické a uzavřít to do "Petričky". A rázem bylo největším problémem opatřit si tuto misku do které bych to všechno mohl zavřít. Poprosil jsem tedy naši vyučující předmětu Cvičení z mikrobiologie, zda by nemohla postrádat pár Petriho misek a pak už vše mohlo naplno začít.
Zde vidíte veškerý materiál a potřeby, které jsem použil pro zhotovení svého mikrobiologického zátiší. Na následujících řádcích se pokusím popsat k výrobě jakých nástrojů a pomůcek jsem je použil i to, k čemu tyto věci slouží ve skutečném provozu.
Bakteriologická klička - nástroj bez něhož by byl mikrobiolog, potažmo bakteriolog jako bez ruky. Kličky existují v různých objemech (průměr očka) a používají se k očkování (nanášení) bakterií na kultivační půdy, pro přípravu suspenzí za účelem vzniku nativního i barveného preparátu a podobně. Existují v podstatě dva typy kliček: Sterilní plastové (jednorázové) a kličky platinové či z jiných kovů, které se musejí žíhat nad kahanem, aby se zajistila jejich sterilita. Já jsem si ke ztvárnění vybral kličku kovovou, které jsou i v běžném provozu rozšířenější a v tomto měřítku podstatně snáze reprodukovatelné.
Samotná klička vznikla obtočením drátku přibližně odpovídajícího průměru kolem vrtáku o průměru 1mm. Držák kličky jsem zhotovil z plastové kulatiny jejíž přední konec byl zabroušen a následně jsem z pásku plíšku doplnil objímku sloužící k uvolnění šroubu a tím i kličky z držáku. Stejně jako objímka vznikla i izolace v zadní části násady, která zřejmě slouží jako ochrana před popálením při rozžhavení kličky během žíhání.
V dalším kroku bylo nutné kličky realisticky nabarvit. Kličky i přední objímky jsem vymaskoval pomocí pásky Tamiya a držáky nastříkal stříbrnou barvou Tamiya LP-11 z řady lacquer. Po odmaskování kovových částí jsem je raději přetřel lesklým akrylovým lakem Tamiya X-22 abych zabránil případné korozi. Izolace na konci držáku mívají různé barvy, od mléčně průsvitné, přes bílou, žlutou, béžovou, červenou, modrou až po černou. Já jsem si vybral mléčně šedavou, takovou, jakou používám během cvičení na praktikárně. Použil jsem barvu Vallejo 993.
Zápalky v mikrobiologické laboratoři slouží především k zapalování plynových kahanů nad nimiž se vypalují kličky, pinzety, hrdla lahví se sterilními roztoky nebo třeba inokulátory pro testování minimální inhibiční koncentrace antibiotik mikrodiluční metodou (tzv. ježci). Nad plamenem kahanu lze také například sušit suspenze bakterií před barvením (v dostatečné výšce nad plamenem) a protažením nad plamenem se vzorky před barvením fixují.
S výrobou zápalek v podobném měřítku již mám zkušenost a tak jsem přesně věděl, jak budu postupovat. Na internetu jsem si našel rozloženou krabičku sirek z produkce firmy SOLO Sušice s motivem dýmky, z níž jsme brali zápalky během naší praxe na mikrobiologii, konkrétně během našich "odpolední na praktikárně" a ve zmenšené podobě si ji několikrát vytisknul na běžný kancelářský papír.
Následně jsem vnější část krabičky vyřezal, naohýbal a slepil. Vnitřní krabičku jsem si narýsoval na křídový papír a opět vytvaroval a slepil. Jednotlivé zápalky byly nařezány z balsového dřeva a hlavičky sirek vznikly namočením dřívek do hnědé barvy Vallejo 984. Pokud sirky budete skládat do krabičky ještě s mokrými hlavičkami, přichytí se barvou a již není třeba je nijak lepit. Pak už stačilo jen krabičku zasunout do vnějšího obalu. Vypálená sirka vznikla podobně, jako nepoužité zápalky v krabičce, jen jsem místo hnědé barvy použil černou Vallejo 950 a "sirku" poválel mezi prsty, čímž nabyla pokrouceného tvaru jenž vzniká hořením dřeva.
Srovnání skutečných zápalek a jejich čtyřnásobné zmenšeniny.
Krevní agar (KA) je nejrozšířenější mikrobiologické kultivační médium, protože na něm roste velká většina lékařsky významných bakterií a zároveň jde o půdu částečně diagnostickou, jelikož zde můžeme pozorovat schopnost rostoucích bakterií rozkládat krvinky obsažené v agaru. Připravuje se přidáním 5-10% sterilní ovčí krve k živnému agaru a tím pádem má jasně červenou barvu (na rozdíl od čokoládového agaru, který je hnědý - krev se přidává za vyšší teploty, při níž dojde k rozpadu krvinek a uvolnění jejich obsahu). V lékařské mikrobiologii se samozřejmě používá pestrá řada speciálních půd jejichž složení napomáhá k identifikaci či růstu bakterií na základě jejich charakteristických vlastností, např.: Endova půda, McConkey agar, CIN agar, Claubergova půda, "MHčko" apod., ale jsem přesvědčen o tom, že rozebírat jejich složení a využití je pro účely tohoto článku zbytečné…
Pevné kultivační půdy se nalévají do Petriho misek, dnes již masově převládá nákup hotových půd v plastových "Petričkách", ale v některých laboratořích si půdy stále vaří sami.
Já jsem čtyřikrát zmenšenou Petriho misku vytvořil z platíčka od bylinných pastilek a "krevňák" vzniknul smícháním akrylového resinu MIG productions se šarlatovou barvou Vallejo 817 a kapkou hnědé 984. Akrylový resin při tuhnutí ztrácí na objemu, proto bylo nutné nanést pět vrstev a nakonec jsem "agar" ještě přetřel lesklým akrylovým lakem Tamiya X-22. Ve skutečnosti agar samozřejmě není nalitý až k hornímu okraji misky, ale při použití tohoto postupu se mi nepodařilo tuto skutečnost věrněji reprodukovat.
Když už máme kultivační médium i kličky, můžeme si nechat poslat vzorek (stěr, hnis, punktát, sputum, výplach, moč...) a začít očkovat (nanášet) na půdu. Očkování se provádí mnoha různými způsoby avšak všechny mají svá pevná pravidla. V našem případě se nejprve vytvoří oválné inokulum a následně se tvoří čáry a hádek, které slouží ke kvantifikaci nárůstu bakterií. Mezi očkováním jednotlivých čar je třeba kličky žíhat nad kahanem, jinak by veškerá práce pozbyla smyslu. Naočkované půdy se umístí do termostatu (zařízení udržující stálou teplotu) a bakterie se nechají růst. Doba inkubace i její ostatní podmínky (teplota, přítomnost/nepřítomnost kyslíku, apod.) jsou pro jednotlivé druhy bakterií typické.
Růst bakterií samozřejmě kopíruje pohyby kličky při očkování. Při kultivaci biologického materiálu se většinou jedná o směs více druhů bakterií, v mém případě vidíme pouze čisté kolonie prozrazující svým vzhledem že zřejmě půjde o nějakého koaguláza negativního stafylokoka. Já jsem si vybral Staphylococcus epidermidis, což je bakterie běžně se vyskytující na pokožce lidského těla. Vyznačuje se bílými koloniemi bez hemolýzy (projasnění KA pod koloniemi vzniklé rozkladem krvinek), protože hemolýza by byla velice těžko ztvárnitelná. Jak je z předchozích slov patrné, každá bakterie roste v koloniích, které mají více méně typický vzhled a zkušený mikrobiolog tak mnohdy již na první pohled pozná s čím má tu čest. Vpravo nahoře vidíte snímek skutečného Stahpylococcus epidermidis na naší vlastní fotografii, kterou jsme si se spolužákem Filipem pořídili na praxi, konkrétně během našeho bakteriologického projektu a s jehož souhlasem ji zde zveřejňuji.
Já jsem bakteriální kolonie znázornil pomocí štětce za použití bílé olejové barvy.
Mé čtyřikrát zmenšené exempláře vzniknuly nařezáním z číré plastové desky.
Nativní preparát, jak už název napovídá není fixován, ani barven, tudíž pozorované objekty jsou v "surovém" a živém stavu. V bakteriologii nativní preparát slouží především k pozorování pohybu bakterií (Proteus sp., Treponema pallidum - původce syfilis), k průkazu jemných mikroorganismů (spirochety, leptospiry, borrelie, atd.) a ke sledování buněčného dělení. Nativní preparát se pak může mikroskopicky prohlížet v procházejícím světle nebo v zástinu, kde se pozorované objekty jeví jako světlé na černém pozadí (např. můj oblíbený Proteus sp. působí jako hvězdné nebe). Nativní preparát se připravuje tak, že se suspenze přikryje krycím sklem (bez vzniku vzduchových bublin) a přiložené krycí sklo se zapečetí orámováním parafínem, aby se zamezilo vysychání vzorku.
Miniatura nativniho preparátu vznikala až na pár detailů stejně, jako jeho skutečná předloha. Na podložní sklo jsem umístil čtvereček čiré fólie (bez nanesení vzorku) a orámoval jej parafínem. Použil jsem k tomu rozžhavenou čepel skalpelu, kterou jsem položil na čajovou svíčku a následně k hraně krycího skla, kde se vytvořil rámeček. V reálném provozu se k tomuto úkonu používá tzv. hokejka což je zahnutý kovový nástroj, jenž mi často až přehnaně připomíná imbusový klíč přikládaný k nábytku v obchodech IKEA…
Příprava barvených preparátů je jednou z nejzákladnějších činností každého mikrobiologického laboranta pracujícího na bakteriologii. V tomto oboru se využívá celá řada barvících postupů přičemž každý slouží k průkazu malinko jiných struktur, nicméně všechny si kladou za cíl pomoci v diagnostice zachycených mikroorganismů. Nejzákladnější bakteriologické barvení je dle Grama - rychlá a jednoduchá metoda využívající různé stavby bakteriální stěny a tím i její barvitelnosti. Mikroskopicky pak rozlišujeme G+ (Gram pozitivní) bakterie (barví se modře/modrofialově) a G- (Gram negativní) bakterie (barví se červeně/růžovočervěně). Další podstatná informace, již nám "Gram" sdělí je prostorové uspořádání jednotlivých bakterií, díky kterému je následná identifikace spolu s barvitelností a makroskopickým vzhledem kolonií opět značně usnadněna.
Mezi další barvící metody patří např. barvení dle Ziehl-Neelsena pro průkaz acidorezistentních tyčinek, které se díky stavbě své stěny nedají barvit dle Grama (sem patří např. mykobakteria - M. tuberculosis = původce tuberkulózy), barvení dle Burriho pro znázornění opouzdřených bakterií (pouzdro = "ochranná" vrstva bakterie, která ji chrání před účinky imunitního systému), barvení dle Giemsy pro průkaz prvoků v parazitologii (např. Trichomonas vaginalis = původce zánětů pochvy a močové trubice, plasmodia = původci malárie, apod.), barvení dle Wirtze-Conklina k průkazu spór (mimořádně odolné klidové formy bakterií přežívající i stovky let) atd..
Postup barvení je většinou takový, že na řádně označené sterilní podložní sklo naneseme materiál, respektive jeho suspenzi ve fyziologickém roztoku (0,9% roztok NaCl), necháme dokonale zaschnout a preparát fixujeme protažením skla nad plamenem kahanu, čímž dojde k usmrcení bakterií (při barvení dle Giemsy se používá šetrnější fixace pomocí methylalkoholu).
Jak je jistě patrné, já jsem byl okolnostmi nucen postupovat při výrobě malinko odlišným způsobem, nejprve jsem imitoval zaschlý vzorek a až poté označil skla. Ale k tomu se dostaneme… Zaschnutá suspenze vzorku se jeví jako matná skvrna na lesklém podložním skle, takže jsem na již připravená "skla" štětcem namaloval oválné skvrny za použití syntetického matného laku Model Master 1560.
Výroba dermografů byla velice snadná z toho důvodu, že nemají hexagonální průřez, nýbrž průřez kruhový. A tak stačilo vzít kulatinu odpovídajícího průměru, zkrátit ji na požadovanou délku, skalpelem ostrouhat jeden konec (dermografy se skutečně strouhají nožem) a tužku nabarvit. Černá - Vallejo 950, žlutá - Vallejo 952, odhalené dřevěné partie Vallejo 819.
Označení podložního skla tedy probíhá za použití dermografu. Běžně se na jedno sklo nanáší dva vzorky. Z důvodu lepší přehlednosti se zóna pro nanesení vzorku označuje oválem nad který se zapisuje číslo pacientského vzorku aby nedošlo k záměně, což by byla fatální chyba.
Já jsem z jistě pochopitelných důvodů místo dermografu použil lihový fix, protože dermograf jednak nevlastním, práce s ním v této miniaturní podobě by byla značně složitá a výsledek by stejně nebyl uspokojivý. Mimochodem… Zkuste si odmyslet již "nanesené vzorky".
Nanášení vzorku na označené a vysterilizované sklo se provádí vyžíhanou kličkou. Důležitá poznámka: Vzorky se nanáší na opačnou stranu skla než kde se nachází popisky dermografem.
V mém miniaturním případě slouží tento krok pouze k ilustraci reálného postupu, protože "vzorky" byly naneseny již dříve za použití štětce.
Skla se zaschnutými vzorky po fixaci připravená k barvení dle Grama.
Gramovo barvení - jeho výsledek. Makroskopicky ("okem proti oknu") na skle vidíme pouze barevnou skvrnu v místě, kam jsme nanesli vzorek, někdy hustší, jindy řidší, někdy se dokonce zdá, že veškerý vzorek byl při barvení spláchnut. Moje zkušenost je taková, že když se mi makroskopicky obarvené sklo líbí, mikroskopicky to zase až taková sláva není.
K barvení se používá krystalová violeť, Lugolův roztok, acetonaklohol a safranin/karbolfuchsin. Postup má každá laboratoř, potažmo každá laborantka/laborant malinko odlišný na což jsme na praxi také někteří narazili. Po dokonalém vyschnutí obarveného vzorku se pozoruje mikroskopicky při 1000násobném zvětšení a hodnotí se vzhled jednotlivých bakterií. Na obrázku vpravo dole vidíte opět našeho epidermálního stafylokoka barveného dle Grama (G+ koky ve shlucích). Fotografie opět pořízená ve spolupráci se spolužákem Filipem, Bc. Petrou Procházkovou, DiS. a Mgr. Petrou Lužnou z ústavu histologie, kterým patří velké poděkování. Ve zmenšené podobě jsem samozřejmě nepoužíval výše uvedená barviva, nýbrž barvy Vallejo 945 a 962. Ty jsem si silně naředil vodou a nanášel je na na obě strany skla a především na "vzorky". Poměry barev jsem vzájemně měnil abych dosáhl variability odstínů a rubovou stranu skla jsem lehce otřel tak, aby zbyly jen šmouhy, kterých se ani při skutečném barvení vždycky nezbavíte. Myslím, že výsledek je značně realistický.
Pracovní deska. Tady není moc co vysvětlovat, prostě deska stolu na němž se pracuje. V mikrobiologických laboratořích můžou být z různého materiálu s různým potiskem, bílé skleněné nebo dřevotřískové laminované. Já jsem si vybral vzor, který vidíte na fotografii i když později jsem si všimnul že na praktikárně je vzor trošku jiný. Upřímně řečeno vymyslet jak budu právě tuto část celého zátiší reprodukovat mi trvalo asi nejdéle. Přemýšlel jsem o tupování barev na šedý podklad ale věděl jsem, že příliš přesvědčivých výsledků touto technikou nedosáhnu jelikož vzor se v určitém intervalu pravidelně opakuje. Nakonec jsem si uvědomil, že nejefektivnějším řešením bývá často to nejjednodušší a tak jsem si požadovaný vzor našel v dostatečném rozlišení na internetu a vytisknul jej na křídový papír. Vzhledem k měřítku jsem neřešil ztvárnění struktury desky a vytisknutý vzor jsem pouze podlepil silnějším kartonem.
Aby bylo možné vše vsadit do Petriho misky musel jsem samozřejmě přizpůsobit tvar podkladové pracovní desky.
Nyní už máme vše připraveno a nic nebrání finální kompletaci celého díla. Původně jsem plánoval ještě disky napuštěné antibiotiky a "ježky" pro inolulaci mikrotitračních destiček, ale nakonec se ukázalo, že tohle bude bohatě stačit. Navíc o "ježka" jsem se skutečně pokusil, ale nepovedlo se mi jej v tomto měřítku realisticky reprodukovat. Zkrátka zabodat 48 drátků do balsové destičky v pravidelných rozestupech není vůbec jednoduché…
Jak je z fotografie patrné, připravil jsem si ještě buničinový čtverec na který se běžné odkládají obarvená skla připravená k mikroskopickému hodnocení.
Jako první jsem musel do misky vsadit podklad, tedy pracovní desku. Ačkoli se zdálo, že bude na svém místě držet i bez lepení, rozhodl jsem se nic neponechat náhodě a podklad ke dnu misky přichytit pomocí disperzního lepidla Herkules. Člověk nemusí být žádný velký myslitel aby věděl, že Herkules zrovna nevyniká v lepení nesavých materiálů jako je plast, tedy vůbec je nelepí. Ale v tomto případě nejde o nijak extrémně namáhaný spoj a tak byl Herkules mnohem jistější volbou než například kyanoakrylátová vteřinová lepidla, u kterých bych riskoval zamlžení čiré misky.
Pohled na Petriho misku zespoda. Je zde patrné, že vlepení pracovní desky neproběhlo zrovna dvakrát čistě a stopy lepidla jsou krásně viditelné, což není ta nejlepší vizitka. Zároveň si můžete povšimnout popisku na dně misky, který stejně jako v reálu označuje její obsah. Standardně se sem píše číslo vzorku a následný nález, pokud kultivujeme již známou bakterii tak misku popisujeme právě názvem této kultivované bakterie.
Na tomto snímku je již vše umístěno a přilepeno k pracovní desce. Při rozmisťování jednotlivých objektů jsem se snažil rozhodně nedodržovat jakoukoli pravidelnost a pravé úhly, čímž by výsledný vzhled značně utrpěl. Na druhou stranu zde prezentuji situaci na pracovním stole tak, jak by neměla vypadat a to je absolutní zmatek a neuspořádanost pracovního místa. Všichni však dobře víme, že přesně takhle to nakonec vypadá. I ty vyškrtané sirky se válí všude možně, zvláště pak po studentech. A to ani nezmiňuji v jakém stavu po sobě nechávají praktikárnu medici…
Kličku, Petriho misku s krevním agarem s nárustem Staphylococcus epidermidis a dermografy jsem k podkladu lepil vteřinovým lepidlem, vše ostatní jsem lepil Herkulesem. Nejsložitější bylo lepení skel, protože ta jsou přirozeně průhledná a stopa po lepidle bude vždy dobře patrná. Snažil jsem se tedy lepidlo nanášet přesně pod matné plochy vzniklé po nanesení vzorků na skla, čímž se viditelnost stopy po lepidle minimalizovala.
Úplně na závěr jsem vyleštil stěny misky i víčko, misku zavřel a víčko zajistil omotáním obou dílů misky průhlednou lepící páskou tak, jak jsme to na cvičení dělali v případě Fortnerovy metody. I když tam se vlastně víčko přikládá obráceně, aby se zabránilo vstupu vzduchu dovnitř misky…
Zde již pohled na dokončené dílo.
A nakonec rekapitulace:
1 - Zápalky sloužící např. k zapalování plynových kahanů.
2 - Bakteriologická klička používaná k očkování vzorků na půdy, podložní skla apod..
3 - Petriho miska s krevním agarem (KA) a naočkovanou bakterií Staphylococcus epidermidis.
4 - Dermografy - tužky k popisování skla.
5 - Nativní preparát sloužící např. k pozorování pohybu bakterií.
6 - Podložní skla s nanesenými vzorky připravená k barvení.
7 - Skla se vzorky obarvenými technikou dle Grama pro pozorování mikroskopického vzhledu bakterií odložená na čtverci buničiny.
Doufám, že se Vám můj dnešní článek líbil a i když uznávám, že to zřejmě nebylo o něčem, co je středem zájmu mých čtenářů tak pevně věřím, že jste si třeba trošku rozšířili obzory a opět alespoň částečně nahlédli do předmětu mého studia a jednou snad i zaměstnání. Takže z mé strany je to prozatím vše, zatím se mějte hezky a budu se těšit u dalších článků.
Michal Trlica
Žádné komentáře:
Okomentovat